[ ここから本文 ]
主な研究成果
リアルタイムPCRによるヨーネ病の遺伝子診断
感染牛からのヨーネ菌分離培養は重要な診断方法ですが、本菌は固形培地での増殖が極めて遅くコロニーを形成するまでに2〜5ヶ月間を必要とします。このような長期間を必要とする診断法に替わって、糞便中のヨーネ菌特異的遺伝子を検出することにより、数時間以内に判定が可能な迅速診断方法を開発しました。 本法を用いることにより、菌の培養成績が出るまでの2ヶ月間以上、感染牛が環境中へヨーネ菌を排出し続けることを防ぐことが可能であり、ヨーネ病防疫を効率的に進めることが可能となりました。平成18年11月に農林水産省消費・安全局動物衛生課から出されたヨーネ病検査要領では、自主淘汰の為の検査方法として本遺伝子検査が採用されています。
専門（農業食品産業関連・研究者・技術者）の方へ
液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法．
液体培地を用いてヨーネ菌を培養することにより、ヨーネ菌の分離率が高まり、培養液中のヨーネ菌DNA量をリアルタイムPCRで定量することにより、培養開始後2週間という短時間でヨーネ菌の増殖を検出することが可能である。
リアルタイムPCRによるヨーネ病遺伝子診断法．
2ヶ月以上を必要とする従来のヨーネ菌分離培養検査に比べ、糞便中ヨーネ菌遺伝子をリアルタイムPCR法により検出・定量することにより、数時間以内にヨーネ菌排菌牛を摘発することが可能である。
本成果の発表論文等：
- 「牛のヨーネ病防疫対策要領」及び「ヨーネ病検査要領」.
農林水産省消費・安全局動物衛生課. (2006).
バイオインフォマティックスにより開発された鳥型結核菌の分子疫学的手法．
抗酸菌のゲノムデータベースの生物情報学的比較解析等により、鳥型結核菌のゲノム上に散在する多型縦列反復配列領域を特定した。対応する多種類の多型縦列反復配列領域の反復数の並びは、鳥型結核菌系統樹における位置情報を持った遺伝子型となり、鳥類・家畜・野生動物・人における鳥型結核菌の動態を迅速、簡便、詳細に追跡するために用いる。
本成果の発表論文等：
- VNTR型別の基礎と応用
西森 敬. 結核. 81, p.697-700 (2006). - VNTR（Variable Numbers of Tandem Repeats）型別による結核菌群及び鳥型結核菌の分子疫学的解析マニュアル. (PDF, 120KB)
西森 敬 他. 動物衛生研究所研究報告. 109, p.25-32 (2002).
牛ウロコルチン2遺伝子の新規クローニングと発現定量．
牛の神経ペプチドの一種、ウロコルチン2（Ucn2）の牛ヨーネ病における役割を解明する為に、牛Ucn2遺伝子の塩基配列を世界ではじめて確定し、その塩基配列を元に牛Ucn2のｍRNA遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRにより定量する。
本成果の発表論文等：
- Bos taurus Ucn2 mRNA for urocortin. complete cds.
Wang and Momotani (2004). 遺伝子DB登録：Gene Bank accession No. NM_001032301. 9月6日登録
ヨーネ病の早期診断法に用いる遺伝子組換え抗原．
ヨーネ菌遺伝子発現ライブラリーを作製し、2つのインターフェロン・ガンマ（IFN-γ）誘導抗原遺伝子クローンを得た。これらの遺伝子組換え抗原は、ヨーネ菌感染牛由来末梢血単核球に対して高いIFN-γ誘導能を示す。さらに、抗インターロイキン10（IL-10）抗体を添加するとIFN-γ産生量が増加し、ヨーネ菌の感染を高感度に検出できる。
本成果の発表論文等：
- Expression cloning of gamma interferon-inducing antigens of Mycobacterium avium
subsp. Paratuberculosis.
Nagata R., Muneta Y., Yoshihara K., Yokomizo Y., Mori Y.
Infection and Immunity. 73, p.3778-3782 (2005).
（和文要旨：「動物衛生研究所 研究報告 No.113」 p.76） - ヨーネ病の早期診断法に用いる遺伝子組換え抗原. (PDF, 281KB)
永田 礼子. 動衛研ニュース. 24, p.4-5 (2006)
ウロコルチン遺伝子の発現を指標としたヨーネ病の診断法．
ヨーネ菌抗原を牛の血液に添加して培養後にウロコルチンの遺伝子発現を測定することで感染を判定する診断法で、ELISA法や細菌培養法などの公定法で陰性を示す不顕性感染牛も診断可能な新技術である。
本成果の発表論文等：
- ウロコルチン遺伝子の発現を指標としたヨーネ病の診断法. (PDF, 275KB)
百溪 英一. 動衛研ニュース. 26, p.4-5 (2006). - Bos taurus UCN mRNA for urocortin.
Wang and Momotani. 遺伝子DB登録：Gene Bank accession No. NM_001032301 (2004) - ヨーネ病診断用プライマーおよびウロコルチン遺伝子の発現定量法によるヨーネ病の診断法.
百溪 英一、王 宏宇. 特許出願（特願2005-291868）
増感in situ hybridization法によるヨーネ菌特異的遺伝子IS900検出法．
ヨーネ病に罹患した牛の腸間膜リンパ節にみられる肉芽腫病変内において、タイラマイド増感in situ hybridization法は、ヨーネ菌が特異的に保有する挿入遺伝子IS900を高感度に検出する。
本成果の発表論文等：
- Inflammatory cytokine gene expression in different types of granulomatous lesions
during Asymptomatic Bovine Paratuberculosis.
Tanaka S., Sato M., Onitsuka T., Kamata H., Yokomizo Y.
Veterinary Pathology. 42, p.579-588 (2005).
（和文要旨：「動物衛生研究所 研究報告 No.113」 p.81）
蛍光染色試薬carboxyfluorescein diacetate succinimidyl (CFDA) および同 succinimidyl estere (CFDA/SE) を用いたヨーネ菌の簡易生死判定と蛍光ラベル法．
ヨーネ菌の生存確認には数ヶ月の培養期間を要する。しかし、生きた細胞を染める蛍光染色試薬CFDAを用いて染色を行うことにより、ヨーネ菌の生死判別が簡易にできる。また、CFDA/SEは生菌死菌ともに強く蛍光染色し、生死菌の細胞・組織内トレースを行う場合の蛍光プローブとしての使用が可能である。